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Les enzymes de restriction & l'ADN ligase

Digestion par des enzymes de restriction. Extrémités cohésives et extrémités émoussées. Réactions de ligature.

Les points clés :

Les enzymes de restriction sont des enzymes qui coupent l'ADN. Chacune reconnaît une ou quelques séquences cibles et coupent l'ADN au niveau ou à proximité de ces séquences.
De nombreuses enzymes de restriction effectuent des coupures décalées, ce qui expose des extrémités d'ADN simple brin. Cependant, certaines produisent des extrémités émoussées (droites).
L'ADN ligase est une enzyme qui soude l'ADN. Si deux morceaux d'ADN possèdent des extrémités complémentaires, la ligase peut les relier pour former une molécule d'ADN unique et ininterrompue.
Dans le clonage de l'ADN, les enzymes de restriction et l'ADN ligase sont utilisées pour insérer des gènes et d'autres fragments d'ADN dans des plasmides.

Comment couper et coller de l'ADN ?

Lors du clonage de l'ADN, les chercheurs fabriquent de multiples copies d'un fragment d'ADN, tel qu'un gène. Dans de nombreux cas, le clonage consiste à insérer le gène dans un morceau d'ADN circulaire appelé un plasmide, qui peut être copié dans des bactéries.

Comment des fragments d'ADN issus de différentes sources (comme un gène humain et un plasmide bactérien) peuvent-ils être assemblés pour former une seule molécule d'ADN ? Une méthode courante fait appel aux enzymes de restriction et à l'ADN ligase.

Une enzyme de restriction est une enzyme qui coupe l'ADN et qui reconnaît des sites spécifiques dans l'ADN. De nombreuses enzymes de restriction effectuent des coupures décalées dans ou à proximité de leurs sites de restriction, ce qui génère des extrémités d'ADN simple brin qui dépassent.
Si deux molécules d'ADN possèdent des extrémités complémentaires, elles peuvent être jointes par l'ADN ligase. L'ADN ligase est une enzyme qui comble les vides entre les molécules, formant ainsi un seul morceau d'ADN.

Les enzymes de restriction et l'ADN ligase servent souvent à insérer des gènes et d'autres fragments d'ADN dans des plasmides lors du clonage de l'ADN.

Les enzymes de restriction

Les enzymes de restriction sont présentes chez les bactéries (et les autres organismes procaryotes). Elles reconnaissent et lient des séquences d'ADN spécifiques, appelées des sites de restriction. Chaque enzyme de restriction ne reconnaît qu'un ou quelques sites de restriction. Lorsqu'elle rencontre sa séquence cible, l'enzyme de restriction effectue une coupure double brin dans la molécule d'ADN. En général, la coupure s'effectue au niveau ou à proximité du site de restriction, selon un motif ordonné et prévisible.

[Pourquoi les bactéries possèdent-elles des enzymes de restriction ?]

Pour illustrer comment une enzyme de restriction reconnaît et coupe une séquence d'ADN, prenons l'exemple de EcoRI, une enzyme de restriction couramment utilisée en laboratoire. EcoRI coupe au niveau du site suivant :

Lorsque EcoRI reconnaît et coupe ce site, elle le fait toujours selon un motif très spécifique qui produit des extrémités d'ADN simple brin qui dépassent :

Si un autre fragment d'ADN présente des extrémités correspondantes (par exemple, parce qu'il a également été coupé par EcoRI), ces dernières peuvent se coller sous l'effet de l'appariement complémentaire des bases. C'est pourquoi on dit que les enzymes qui exposent des bouts d'ADN simple brin produisent des extrémités cohésives. Les extrémités cohésives sont utiles pour le clonage, car elles maintiennent la cohésion de deux morceaux d'ADN afin qu'ils puissent être liés par l'ADN ligase.

Toutes les enzymes de restriction ne génèrent pas des coupures à bouts collants (extrémités cohésives). Certaines réalisent des coupures franches, en coupant directement au milieu d'une séquence cible sans laisser d'extrémités qui dépassent. Par exemple, l'enzyme de restriction SmaI effectue des coupures droites :

Les fragments à bouts droits peuvent être reliés les uns aux autres par l'ADN ligase, mais c'est plus difficile. En effet, la réaction de ligature est moins efficace et plus susceptible d'échouer, car il n'y a pas d'extrémités d'ADN simple brin pour maintenir les molécules d'ADN en position.

[D'où vient le nom bizarre des enzymes de restriction ?]

L'ADN ligase

Si vous avez étudié la réplication de l'ADN, vous avez probablement déjà entendu parler de l'ADN ligase. Dans le cadre de la réplication de l'ADN, le rôle de la ligase est de joindre les fragments d'ADN nouvellement synthétisés pour former un brin homogène. Les ligases utilisées dans le clonage de l'ADN font à peu près la même chose. Si deux morceaux d'ADN présentent des extrémités complémentaires, l'ADN ligase peut les réunir pour former une molécule continue.

Comment l'ADN ligase procède-t-elle ? En utilisant l'ATP comme source d'énergie, la ligase catalyse une réaction dans laquelle le groupe phosphate qui se détache de l'extrémité 5' d'un brin d'ADN est lié au groupe hydroxyle qui se détache de l'extrémité 3' de l'autre brin. Cette réaction génère un squelette sucre-phosphate intact.

Exemple : construire un plasmide recombinant

Voyons comment la digestion par des enzymes de restriction et la ligature peuvent servir à insérer un gène dans un plasmide. Supposons qu'on dispose d'un gène d'intérêt flanqué de sites de reconnaissance EcoRI, et d'un plasmide contenant un seul site EcoRI :

Notre objectif est d'utiliser l'enzyme EcoRI pour insérer le gène dans le plasmide. Tout d'abord, on digère (coupe) séparément le gène et le plasmide avec l'enzyme EcoRI. Cette étape génère des fragments avec des extrémités cohésives :

Ensuite, on prend le gène et le plasmide linéarisé (ouvert) et on les combine grâce à l'ADN ligase. Les bouts collants des deux fragments s’assemblent par appariement complémentaire des bases :

Une fois réunis par la ligase, les fragments constituent un unique morceau continu d'ADN. Le gène d'intérêt est maintenant inséré dans le plasmide, ce qui donne un plasmide recombinant.

La digestion et la ligature impliquent de nombreuses molécules d'ADN

Dans l'exemple ci-dessus, on a vu le résultat de la ligature d'un gène et d'un plasmide digérés par EcoRI. Cependant, ce n'est pas le seul résultat possible. Par exemple, le plasmide coupé pourrait se circulariser à nouveau (se refermer) sans incorporer le gène. De même, le gène peut être introduit dans le plasmide, mais se retrouver à l'envers (puisque ses deux extrémités cohésives EcoRI sont identiques).

Les digestions et les ligatures comme celle-ci sont réalisées à partir de multiples copies du plasmide et du gène. En fait, des milliards de molécules d'ADN sont utilisées pour une seule ligature ! Toutes ces molécules se heurtent les unes aux autres et à l'ADN ligase, de différentes manières et au hasard. Ainsi, si plusieurs produits sont possibles, ils seront tous fabriqués à une certaine fréquence, y compris ceux non désirés.

Comment se débarrasser des "mauvais" plasmides ? Lorsqu'on transforme des bactéries avec de l'ADN issu d'une ligature, chaque bactérie capte un morceau d'ADN différent. On peut vérifier les bactéries après transformation et n'utiliser que celles qui comportent le bon plasmide. En général, le plasmide des bactéries transformées est analysé en le digérant avec une autre enzyme de restriction pour vérifier qu'il contient le bon insert, dans la bonne orientation.

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